本发明公开了用于耐药基因检测的蓝藻环境样品胞内外DNA分离提取方法，包括将待测蓝藻环境样品浓缩和清洗，然后确认藻液中杂菌对溶菌酶具有敏感性；藻液中加入溶菌酶溶液去除其中的杂菌，然后去除剩余溶菌酶溶液，得到预处理后的藻液；预处理后藻液转代培养，检测转代培养后的藻液中是否仍存在杂菌；若是，则重复去除杂菌的步骤，直至转代培养后的藻液中无杂菌；若否，则分离提取预处理后藻液的胞外和胞内DNA。本发明操作简单、节省时间，提取的蓝藻环境样品DNA纯度高、完整性好，避免了传统抗生素灭除杂菌方法对蓝藻样品中待测抗生素耐药基因表达水平的干扰，有效提升了后续蓝藻环境样品抗生素耐药基因分子生物学检测的准确性，具有广泛的应用前景。