本发明提供一种应用纳豆芽孢杆菌对岩藻寡糖混合物进行单糖脱除及纯化的方法，将纳豆芽孢杆菌接种含有单糖的岩藻寡糖混合物，获得含有岩藻寡糖，纳豆芽孢杆菌和纳豆激酶的发酵液，离心分离上清液和菌体，上清液超滤获得寡糖滤出液和纳豆激酶截留液，滤出液通过浓缩干燥，获得纯度大于85%的岩藻寡糖，离心菌体重悬后循环使用，纳豆激酶截留液浓缩冻干成粉。本发明纳豆芽孢杆菌发酵法能够脱除岩藻寡糖混合物中的杂单糖，大大提高岩藻寡糖的纯度。工艺设计巧妙合理，发酵获得高值副产物纳豆芽孢杆菌和纳豆激酶，可作为功能性食品的低成本原料，或开发低聚糖—益生菌—活性代谢产物复合的多功能活性产品。