本申请公开一种氧氟沙星抗原的合成方法及其在制备单克隆抗体中的用途，氧氟沙星抗原的合成包括：以碳二亚胺为催化剂，氧氟沙星与甘氨酸合成半抗原；以碳二亚胺和N‑羟基琥珀酰为催化剂，半抗原与牛血清白蛋白偶联合成全抗原。合成的全抗原通过免疫小鼠、细胞融合、单克隆和无抗细胞培养技术成功研制出杂交瘤细胞株，其中一个细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.C202112；该细胞株在体外培养条件下大量分泌高灵敏度、高特异性抗氧氟沙星的单克隆抗体，该抗体对氧氟沙星反应灵敏度高且与恩诺沙星和环丙沙星交叉反应率较低。本申请的单克隆抗体可用于检测动物源性农产品中残留的氧氟沙星。