本发明涉及一种基于孔径梯度分布纳米纤维膜的免疫层析试纸条及其制法，免疫层析试纸条包括底板以及贴附在底板上且依次交叠排列的样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫；层析膜为经过交联处理的孔径梯度分布纳米纤维膜(大孔径纳米纤维膜的孔径为2～3.6μm，孔隙率为60～80％，小孔径纳米纤维膜的孔径为0.8～2μm，孔隙率为70～90％)；制备方法为：将孔径梯度分布纳米纤维膜经过蛋白质交联剂交联处理后作为层析膜，将样品垫、结合垫和吸水垫依次贴附于贴附有层析膜的底板上，制得基于孔径梯度分布纳米纤维膜的免疫层析试纸条。本发明利用孔径梯度的纳米纤维膜大小孔径的组合，不仅在蛋白吸附量上大大提高，又延缓了免疫反应的时间，却不影响整体的试纸检测速度。