本发明公开了一种优质蛹虫草栽培母种的制备方法，其中，所述制备方法包括：步骤1，野外采集标本；步骤2，组织块或子囊孢子分离菌种；步骤3，DNA鉴定；步骤4，菌丝形态显微观察；步骤5，驯化、杂交育种和实验室栽培；步骤6，适合大规模栽培；步骤7，缩短生长周期；步骤8，改善子实体生长性能；步骤9，提高转化率；步骤10，蛹虫草优良菌株；步骤11，蛹虫草栽培母种。本发明针对蛹虫草栽培菌株退化快的问题，通过野外采集标本、组织块或子囊孢子分离菌种、菌丝形态显微观察、DNA鉴定、驯化、杂交育种和实验室栽培等多种技术手段，筛选适于规模化栽培的蛹虫草优良菌株，改善子实体生长性能，提高转化率，缩短生长周期。