本发明公开了一种基于16S rDNA序列的菌种鉴定方法，步骤包括：将参考16S rDNA序列按照引物序列确定参考序列方向；根据预定长度将确定方向后的参考序列进行k‑mer切分；将含有一定数量的简并碱基序列进行展开，构建参考序列的k‑mer索引库；将查询序列按照预定长度进行k‑mer切分，构建k‑mer序列集合；根据特定公式以及特定序列相似性值计算查询序列的最小比对k‑mer数（k_min）；比对参考序列k‑mer索引库，统计查询序列的每个k‑mer的比对情况；根据k_min筛选出符合条件的候选参考序列，分别将查询序列与候选参考序列进行两两比对，计算序列相似性，最终输出查询序列的比对结果。本发明可以缩短海量序列查询时间以及减少海量数据存储空间，并为菌株鉴定提供了一个新的高效的技术手段。