本发明属于免疫学技术领域，尤其涉及抗人白介素‑10高亲和力兔单克隆抗体及其应用。本发明中用单个B细胞筛选和培养技术成功开发了高亲和力的抗人白介素‑10兔单克隆抗体A和B，并证明了这两个抗体可以识别人白介素‑10蛋白表面的不同抗原决定簇，可以用于开发双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒；利用该抗体对开发的双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒，具有特异性高、抗干扰能力强、检测灵敏度高和稳定性好等优点。该方法学的建立，提供了一种能够在血清、细胞培养基样品中稳定检测极微量水平人白介素‑10蛋白的试剂盒。