本发明公开了一种快速区分小肠结肠炎耶尔森氏菌与中间型耶尔森氏菌的检测方法，利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测小肠结肠炎耶尔森氏菌与中间型耶尔森氏菌的肽指纹图谱，根据两种耶尔森氏菌特征峰的不同，鉴定其特征蛋白，区分小肠结肠炎耶尔森氏菌与中间型耶尔森氏菌。本发明采用的方法比现有的传统生化实验鉴定时间缩短1‑2天，可以快速区分小肠结肠炎耶尔森氏菌与中间型耶尔森氏菌，实现快速检测。该方法自动化程度高，检测时间短，有效降低一线检测人员接触食源致病菌的几率，减少食源致病菌对人和环境污染的风险。