本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测玉米转基因品系的引物组、试剂盒及检测方法；所述引物组包括29对检测引物对，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.58所示；引物对中引物的长度为18bp～30bp；所述试剂盒包括引物组；所述方法包括：分别得到玉米转基因品系和玉米内参基因的核苷酸序列；根据核苷酸序列，分别设计出引物组；提取待检样品的基因组DNA，得到待测玉米品系的基因组DNA；以基因组DNA为模板，以引物组为扩增引物进行PCR扩增，得到扩增产物；将扩增产物进行高通量测序，得到高通量测序数据；对高通量测序数据进行分析，确定待测玉米样品中是否含有转基因品系；通过设计出引物长度为18bp～30bp的29对检测引物，在同一PCR反应中实现多个靶标分子的同时检测。