本发明公开了一种同时检测两项肿瘤标志物的方法及其试剂盒，该试剂盒包括微球试剂、生物素试剂、校准品、质控品、校准品的稀释液和质控品的稀释液，所述微球试剂包括偶联HE4特异性单克隆抗体的编码微球、偶联CA125特异性单克隆抗体的编码微球和微球试剂的稀释液；所述生物素试剂包括生物素标记的HE4特异性单克隆抗体、生物素标记的CA125特异性单克隆抗体和生物素试剂的稀释液。本发明的同时检测两项肿瘤标志物的方法及其试剂盒，能够同时检测出女性血清中HE4、CA125两项指标的浓度，实现了指标的定量检测，效率高，操作简单，节约成本，且检测的浓度范围广，所需样本量少，批内批间实验的变异系数小。