本发明提出了一种深海原位环境的单菌落分离装置，包括分离操作培养器、注液单元、取样单元和取样探头装置；还提供一种深海原位环境的单菌落分离方法，在保持分离操作培养器内部压力、温度与深海微生物培养的环境一致的情况下，通过注液单元向分离操作培养器注入微生物菌液，由取样探头装置进行蘸取和划线操作再进行分离培养，最后通过取样单元将单个菌落挑选出来，实现单菌落的分离。本方案通过建立一种单菌落的分离装置，并在保压的情况下，实现单菌落的分离与挑选并进行培养，最终可以获得目标菌，有效提高海洋微生物的可培养性，为海洋微生物的分离和培养提供基础方案。