本发明属于干细胞培养技术领域，尤其为一种自体牙髓提取牙髓干细胞的培养方法，包括牙髓组织，取牙髓组织，剪碎后加入I型胶原酶，37℃，200rpm消化10‑20min，无血清培养基终止消化，吹打离散细胞团块获得单个离散的细胞，得到牙髓干细胞；并将牙髓干细胞放置在培养皿中备用；然后制备温和培养液和牙髓干细胞原代培养液。本发明采用温和培养液和牙髓干细胞原代培养液，保证了细胞间信息信号的传递，使得牙髓干细胞更容易在胶原凝胶内的分裂增殖。由于载体创建的细胞生长环境能够最大程度地模拟体内环境，因此细胞的生长更加健康；避免培养过程中产生髓干细胞的污染，而且有效的提高了整体的生长速度。