本发明公开了一种具有沟槽拓扑结构的壳聚糖微纤维及其制备方法与应用。所述制备方法包括：使摩尔比为0.1~1.0:1.0~10的巯基化壳聚糖与共轭烯酮化壳聚糖混合通过挤压注射，并于碱性溶液中，温度为0~100℃的条件下发生点击加成反应10~60s，获得第一壳聚糖纤维；将所述第一壳聚糖纤维完全浸渍于乙醇水溶液中，并于‑50~100℃发生二次交联反应0.5~48h，之后进行冷冻干燥处理，获得具有沟槽拓扑结构的第二壳聚糖微纤维。本发明利用巯基与共轭烯酮的点击加成原理，实现壳聚糖分子链的快速交联，之后进行溶剂交换，产生径向应力从而形成表面轴向沟槽拓扑结构；制备的具有沟槽拓扑结构的壳聚糖微纤维可定向调控细胞的行为及功能，在再生医学中具备重要的应用价值。