本发明提供一种快速、灵敏检测甲肝减毒活疫苗病毒感染性滴度的方法，它通过检测甲肝病毒复制时出现的标志物负链RNA中间体来确定病毒的存在，突破了现有逆转录聚合酶链式反应不能区分感染性甲肝病毒和失活病毒的局限，同时克服了细胞培养法存在的步骤繁杂，耗时较长，常导致疫苗库存期长，缩短疫苗有效期等不足，使培养时间由一个月缩短至八天，大大缩短了检测周期，病毒培养过程中勿需替换维持液，降低了污染的机率，减少了常规方法中细胞后处理步骤如反复冻融、超声，降低工作量，有效提高工作效率，通过对聚合酶链式反应产物的测序提供病毒遗传信息。