本发明提供了一种光学选择性酰胺酶的筛选方法。所述的方法按如下：取被测含酰胺酶的样品溶于pH为5～9的缓冲溶液中，添加羟胺，使羟胺终浓度为0.5～1.0M，并添加手性的S－酰胺或R－酰胺为底物，使手性的酰胺终浓度为5～30mM，于20～50℃水浴中进行反应，取反应所得转化液添加含Fe³⁺的溶液进行显色，若显红棕色则表明被测样品含有的酰胺酶的光学选择性与底物的立体构型一致或含有的酰胺酶没有光学选择性，若显淡黄色则表明被测样品含有的酰胺酶的光学选择性与底物的立体构型相反。所述方法不需对拟筛选的底物进行衍生化，能够利用简单的比色法快速鉴定所试微生物及其提取物的酰胺酶活性及光学选择性，具有筛选流程简单、速度快、设备要求低、通用性强等优点，为光学选择性酰胺酶的筛选带来了极大的便利。