本发明公开了一种蟾酥类高效液相色谱指纹图谱鉴定方法，采用高效液相色谱法，得出了蟾酥类特有的蟾毒色胺类及蟾毒配基类化学指纹图谱；利用高效液相色谱仪，UV检测器，色谱工作站，取待测蟾酥样品25mg，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇20ml，称定重量，加热回流1h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过0.2μm滤膜即得蟾酥类供试品溶液。将待测蟾酥供试品溶液，在分析柱，流动相：甲醇(A)－缓冲液，进行梯度洗脱，进样量20μl，保留时间90min，即得到蟾酥类各自特有的化学指纹图谱，并对所有特征峰全部或大部分进行化学归属。本方法能准确地测出蟾酥类的高效液相色谱指纹图谱，从而为鉴别蟾酥的真伪和制定蟾酥药材和蟾酥注射液质量标准提供可靠的科学依据。