本发明公开一种细脚拟青霉多糖的分离纯化方法。由下述步骤组成：水提醇沉淀法提取细脚拟青霉多糖成分，阴离子交换层析和凝胶过滤层析反复色谱纯化，真空冷冻干燥细脚拟青霉多糖的提取物，即得细脚拟青霉多糖。利用本发明制备的细脚拟青霉多糖能够最大限度分离纯化细脚拟青霉多糖，既不影响多糖天然的结构又能保持其原有生物活性，且本发明的方法设备及环境要求低，方法简便，成本低，灵活实用，利于推广、开发和应用。