本发明公开了一种验证性筛选目的结构域结合配体的方法。该方法包括以下步骤：1)以目的结构域家族中结合特性有代表性的成员为诱饵蛋白筛选酵母双杂交文库；2)收集步骤1)筛选获得的结合配体克隆以及其它已知或可能的目的结构域结合配体克隆，得到目的结构域结合配体文库；3)以该结构域家族中的其它成员或步骤1)中的成员为诱饵蛋白，用酵母双杂交系统验证性筛选步骤2)构建的结合配体文库，得到目的结构域的阳性和阴性结合配体；4)分析步骤1)和/或步骤3)筛选得到的目的结构域的阳性和阴性结合序列，总结结合特性和共有结合序列；5)预测目的结构域的配体蛋白；6)验证预测的相互作用，得到与目的结构域相互作用的配体蛋白。