本发明提供了一种肿瘤样品测序参考品的制备方法，属于高通量测序技术领域，所述方法包括以下步骤：对肿瘤细胞系进行单克隆培养获得单克隆细胞系并提取全基因组；测定等位基因频率测定；根据等位基因突变频率与目标等位基因突变频率确定稀释倍数；用阴性细胞倍比稀释所述单克隆细胞系获得混合细胞；提取混合细胞的全基因组，测定等位基因突变频率；根据混合细胞的等位基因突变频率与目标等位基因突变频率比较，细化倍比稀释的倍数，用阴性细胞稀释所述单克隆细胞系获得参考品。本发明所述方法采用对细胞株单克隆结合高通量测序确定细胞系的基因背景；使用多步骤逐步细化的倍比稀释法结合流式细胞仪对细胞精确计数，保证参考品制备的高度可重复性。