本发明公开了一种同时测定孔雀石绿和结晶紫含量的方法。将氯化胆碱和酚混合加热后作为萃取剂，样品溶液经水相微孔滤膜过滤后，加入萃取剂和有机硅乳化剂，涡旋形成均匀乳液，静置后离心分相，取上层萃取相进行高效液相色谱测定。本发明以氯化胆碱和酚制备得到低共熔溶剂作为萃取剂，首创以有机硅乳化剂作为增乳剂，形成的乳液中萃取目标物与萃取剂接触充分，萃取完全，再结合高效液相色谱方法，能够同时准确检测低含量的孔雀石绿和结晶紫。该方法乳液形成快，均匀，相分离操作非常容易，具有高效、低毒、操作简单、灵敏度高、重现性好的特点。特别适用于鱼、虾、鳖等水产动物体内，以及水体中孔雀石绿和结晶紫残留的定量分析。