本发明属于生物技术领域，提供了一种同时检测小麦和百萨偃麦草染色体的寡核苷酸探针试剂盒及其使用方法。通过百萨偃麦草基因组测序和生物信息学分析，成功开发出5个能在百萨偃麦草产生信号的寡核苷酸探针，通过与已经公开的小麦探针结合形成了包含13个探针的试剂盒，通过配制寡核苷酸染液，可以实现对小麦、百萨偃麦草及其小麦‑百萨偃麦草杂种后代染色体的批量准确鉴定，可以清晰区分全部小麦和百萨偃麦草染色体，并产生高清晰核型，为小麦‑百萨偃麦草染色体工程提供了有利的工具，这种试剂盒组配的寡核苷酸染液可以循环利用，利于提高原位杂交的自动化和商业化水平。