本发明公开了一种反硝化脱氮细菌复合填料、制备方法及应用，属于水处理技术领域。1)制备方法如下：制备反硝化细菌菌剂，将亲水性聚氨酯海绵体材料浸泡于所述反硝化细菌菌剂中，浸泡结束后，加入至含氯化钙的饱和硼酸溶液中硬化、交联成固定化颗粒；2)配制缓释微生物促进剂，将所述固定化颗粒浸泡于缓释微生物促进剂中、取出经风干固化得到所述复合填料，所述的缓释微生物促进剂中含有琼脂、聚β‑羟基丁酸、聚羧酸盐、微生物所需营养物质和高分子胶粘剂，本发明将固定化包埋技术与生物强化技术结合而制备的新型反硝化脱氮细菌复合填料，相比现有技术中的填料，在实际运行中具有抗系统冲击力强、脱氮处理效率高的优点。