本发明公开了一种基于DIA技术挖掘性成熟前后藏绵羊睾丸差异蛋白质的方法，包括以下步骤：组织收集、蛋白样本制备、建立谱图数据库、蛋白质定性定量分析和差异表达蛋白质筛选。本发明选取3月龄和1岁龄藏绵羊睾丸组织，运用常规DDA质谱检测技术分析并建立图谱数据库，随后采用DIA方法进行质谱数据采集，并对样品中的蛋白质进行定性定量分析，从而获得藏绵羊睾丸中的差异表达蛋白质。利用该方法可实现对藏绵羊睾丸差异表达蛋白的定量筛选，这对于后续从蛋白质组学角度研究在高海拔条件下藏绵羊睾丸发育或精子发生的分子机制提供了十分重要的理论基础。