本发明提供了一种检测血液中水溶性维生素的方法，包括：利用液相色谱‑质谱联用仪检测检测至少三种浓度的混合标准溶液，得第一检测结果，其中，混合标准溶液包括内标物和水溶性维生素，水溶性维生素包括维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B5、吡哆酸、磷酸吡哆醛、维生素B7、维生素B9、5‑甲基四氢叶酸、维生素B12和维生素C；基于第一检测结果和水溶性维生素的浓度拟合水溶性维生素分别对应的标准曲线方程；将加有沉淀蛋白试剂和一定量内标物的待测血液样本离心，取上清液，并利用液相色谱‑质谱联用仪进行检测，得第二检测结果；基于标准曲线方程和第二检测结果，得到待测血液样本中水溶性维生素的浓度。本方案能够提高血液样本的检测效率。