本发明提供了一种基于液相色谱串联质谱同时检测血清中多种水溶性维生素的方法，步骤如下：向血清样品中加入适量内标溶液后，再加入提取剂Ⅰ，涡旋振荡使样品混合均匀，静置，再向样品中加入提取剂Ⅱ，涡旋振荡，将全部样品转移至超滤管中，高速离心，取出超滤管，转移下层离心出来的提取液至进样板中，加入提取剂Ⅲ，涡旋振荡后混合均匀，上样液相色谱‑串联质谱仪进行检测。本方法可以快速准确同时检测血清中11种水溶性维生素，前处理简单易操作，省时省力，高效精准，一次测试、一针进样检测11种水溶性维生素，极大的提高了医疗检验的效率和准确率，方便医者和患者，给人体中水溶性维生素的含量监测提供了有效可行的依据。