本发明涉及一种在丝素蛋白膜上形成纳米孔的方法，包括以下步骤：将质量百分比为1‑8％的丝素蛋白溶液在温度为100‑300℃及压力为0.1‑2000MPa的条件下处理，经离心干燥后得到SilkΙ结构的丝素蛋白纳米颗粒，将丝素蛋白纳米颗粒混合丝素蛋白溶液成膜后采用醇类变性剂溶液进行水不溶处理，得到具有纳米孔的丝素蛋白膜，丝素蛋白膜上分布有多个纳米孔，纳米孔的孔径分布为1‑1000nm。本发明选择高温高压灭菌法制备的纳米颗粒与丝素蛋白溶液共混成膜后纳米颗粒溢出来制备纳米孔丝素蛋白膜，制备过程不需要复杂的装置，操作流程简单易行、耗时短、成本低，而且不添加致孔剂，所制备的纳米孔丝素膜生物安全性高，具有较大实用价值。