本发明涉及一种基于孔板的高通量蛋白质样品预处理方法，是一种集蛋白质提取、变性、还原、烷基化、除盐以及酶解的为一体的方法。需要顺序使用预处理孔板Ⅰ和预处理孔板Ⅱ。生物样品首先加入预处理孔板Ⅰ中，进行蛋白质提取，变性和还原处理，这是由于上述操作的条件比较苛刻，可能会破坏预处理孔板Ⅱ；然后再将样品溶液转移到预处理孔板Ⅱ中进行烷基化捕获蛋白质、除盐以及酶解处理。酶解产生的肽段可以进行质谱检测。本发明的优点是将蛋白质样品预处理过程集成在孔板中进行，可同时处理24‑384个样品。此外，在提取过程中使用细胞裂解酶(如溶菌酶、酵母溶壁)和强提取溶剂(如SDS、离子液体)大大提高微生物蛋白质的提取效率。