本发明提供一个fiber改造的人5型腺病毒（HAdV‑5）质粒及HAdV‑5 fiber改造方法。这个HAdV‑5腺病毒质粒命名为pKAd5f11p228R‑EG；含有E1/E3缺失的HAdV‑5基因组；原E1区位置含有人EF1a启动子控制的绿色荧光蛋白（GFP）基因表达框，GFP编码区两侧分别含有一个限制性内切酶PmeI酶切位点；原HAdV‑5 fiber基因被替换为人工改造的f11p228R基因，f11p228R基因编码HAdV‑5 fiber的tail结构域，HAdV‑11p fiber的shaft和knob结构域，并且其编码的蛋白氨基酸序列228位之后插入有RGD4C短肽序列（CDCRGDCFC）。该腺病毒质粒可以直接用于拯救携带GFP基因的人原代NK细胞靶向重组HAdV‑5，也可以作为构建携带其他目的基因、人原代NK细胞靶向HAdV‑5病毒的起点质粒。预计该质粒可以用于制备人原代NK细胞靶向基因转移载体或基因转导试剂盒。