本发明提供了一种分离艾美尔球虫小配子的方法和应用，涉及球虫分离和纯化技术领域。本发明首次采用基因组编辑技术将外源的荧光蛋白的基因序列与特异性基因进行融合，并将融合基因敲入艾美尔球虫基因组使其融合表达，随后根据荧光蛋白的发光情况来判定整合成功，获得具有荧光球虫。随后将荧光球虫感染鸡，收集富含配子的盲肠，通过进一步消化、过滤等获得混合物，随后根据荧光将大小配子进行分离。本发明还可以应用免疫荧光技术和现代成像分析技术，通过荧光观察球虫大小配子阶段的行为学变化，为球虫病的治疗提供有效的化学筛选模型，也为研究针对球虫小配子的药物和基于小配子的疫苗的研发奠定了基础。