本发明公开了一种用于牛中常见艾美耳球虫检测和虫种鉴定的巢式PCR方法及试剂盒。本发明采用牛的艾美耳球虫SSU rRNA基因作为检测靶序列，所述序列中具有保守区域和可变区域，相应扩增片段中包含多个单核苷多态性位点；本发明进一步通过设计巢式PCR引物，建立了牛中常见艾美耳球虫巢式PCR检测方法，可检测出不同的牛中常见艾美耳球虫，进行艾美耳球虫的虫种鉴定。采用本发明的检测方法能够最低检测到一个卵囊，其扩增效率高，检测灵敏，可以准确区分牛感染的不同艾美耳球虫，并确定引起发病的不同虫种，用于牛球虫病的精准防控。