本发明公开了一种单原子纳米酶及其制备方法与应用，该单原子纳米酶是通过将掺杂金属离子和主体金属离子与有机单体在微流体反应装置中配位形成缺陷态的共轭超分子，再在惰性气氛下对缺陷态的共轭超分子进行高温热解后得到的，有机单体配位形成非金属杂原子掺杂的载体，金属离子与非金属杂原子相互作用，发生部分还原反应，并包覆在多孔超共轭碳载体中以单原子形式存在。本发明提供的制备方法适用于多种金属的单原子体的制备，该制备方法简单易行，制得的单原子纳米酶具有原子级分散活性位点。实验结果表明，本发明制得的单原子纳米酶具有良好的类过氧化物酶活性，在半胱氨酸、抗坏血酸和谷胱甘肽等快速检测领域具有广阔的应用前景。