本发明公开了一种溶酶体定位粘度响应的双光子荧光探针及其制备方法和应用，属于溶酶体分析化学技术领域。本发明溶酶体定位粘度响应的双光子荧光探针的结构式如下：本发明制备工艺简单，产物收率高，本发明的溶酶体定位粘度响应的双光子荧光探针能够实现溶酶体定位及粘度响应，进而达到研究细胞自噬的目的。因此本发明解决了特定细胞器靶向性差和生物样品损伤大的问题，能够应用于检测溶酶体内粘度变化，进而研究细胞自噬。