本发明提供了一种氨基糖苷类抗生素适配体、其亲和柱及其制备方法和应用。本发明提供的氨基糖苷类抗生素核酸适配体，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示，亲和柱是以N‑羟基琥珀酰亚胺修饰的琼脂糖为载体，然后将能够高亲和力、高特异性识别氨基糖苷类抗生素的核酸适配体与载体进行共价偶联，偶联后的产物作为填料装填亲和柱。本发明的亲和柱可至少重复使用23次，对包括卡那霉素A、卡那霉素B、妥布霉素、丁胺卡那霉素在内的四种氨基糖苷类抗生素有很好的净化和富集效果，主要用于饲料、食品、环境样品以及其他复杂样本中氨基糖苷类抗生素的净化和富集，以利于后期对样本中该类抗生素的高效液相色谱和快速检测，具有广阔的应用前景。