本发明属于药物分析技术领域，涉及一种异烟肼中游离肼杂质含量的检测方法。所述的检测方法采用高效液相色谱法，先分别用不同已知浓度的硫酸肼对照品溶液分别上样检测测定二苄肼峰的峰面积后，确定二苄肼峰的峰面积与二苄肼浓度之间的标准曲线，然后再将供试品溶液以同样的检测条件上样检测测定二苄肼峰的峰面积后，将二苄肼峰的峰面积代入所述的标准曲线以确定供试品中游离肼杂质含量。利用本发明的异烟肼中游离肼杂质含量的检测方法，能够方便、快捷、准确的进行异烟肼中游离肼杂质含量的检测。