一种试剂盒及其文库构建方法与污染检测方法，试剂盒包括：第一轮扩增引物、第二轮扩增引物；第一轮扩增引物包含第一上游引物、第一下游引物，第一上游引物含有与靶标序列部分相同的核苷酸序列，第一下游引物含有可与靶标序列的部分核苷酸序列反向互补的核苷酸序列以及用于与靶标序列串联连接的部分接头序列；第二轮扩增引物包含第二上游引物，第二上游引物包含与靶标碱基序列相同的核苷酸序列以及部分接头序列。本发明相比于pane l NGS测序技术，检测周期短，检测周期约是其1/8的时间，并显著降低成本，检测成本约是其1/10。即成本低，周期短，检测精度高。