本发明公开了一种酶联免疫荧光法检测试剂盒及其在检测蛋白含量中的应用。本发明采用双抗夹心法原理设计，捕获抗体包被于固相基材或介质上，加入含待检测物的样品和碱性磷酸酶标记的检测抗体后，则形成双抗体夹心结构的复合物，清洗去除游离成分后再加入聚集诱导发光型荧光底物，酶促反应产生的荧光信号与样品中的待检测物浓度呈正比。本发明开发的检测试剂盒，包括微孔板、磁珠溶液(与预包被微孔板二选一)、校准品、质控品和碱性磷酸酶标记抗体，聚集诱导发光型荧光底物，检测缓冲液，洗液。本发明的检测试剂盒，采用双抗体夹心酶联免疫荧光法，本发明的制备方法制备出的检测试剂盒使用时具有良好的灵敏度和精密度。