本发明公开了一种3D堆叠式多级惯性微流控分选芯片及其制备方法。该芯片包括依次堆叠的六层芯片单元；第一芯片单元上设置有梯形截面螺旋管道。第二芯片单元上设置有第二级主蛇形管道。第三芯片单元上设置有第三级主蛇形管道。第四芯片单元上设置有第四级主蛇形管道。本发明通过平面工艺制得每一层结构后，依靠标记点，相互堆叠键合，制备简单，提高了多级微流控芯片的集成度。本发明制备完成的芯片，仅需要在特定流速下输入混合样本的溶液，能够实现高效分选和降速的自动化，得到的样本溶液可以直接与成像检测系统相连，进行下一步的分析诊断。此外，本发明能够通过堵塞部分出口的方式，在三种模式中切换，以适应不同的分选要求。