本发明公开了用于检测细菌内碳青霉烯酶的免疫层析试纸条及检测方法。用于检测细菌内碳青霉烯酶的免疫层析试纸条，包括依次粘贴在底板上的样品垫、NC膜、吸水垫和底板，其中NC膜上设有检测线和质控线，检测线包被有青霉素‑BSA，质控线包被有His融合标签抗体。本发明还提供用于检测细菌内碳青霉烯酶的试剂盒，包括细菌裂解液、反应孔I、II和所述试纸条；反应孔I包被有美罗培南，反应孔II包被有胶体金标记的PBP 4’受体蛋白复合物。本发明选用性质稳定的美罗培南作为底物，以金标青霉素结合蛋白PBP 4’作为受体，通过检测底物消耗情况间接检测样品中碳青霉烯酶的有无。为细菌内碳青霉烯酶的快速检测提供有力技术手段。