本发明公开了一种作物种质资源分子鉴定方法及其应用，解决了现有的遗传标记对稻种资源进行分类鉴定，因多态性标记较少，鉴定结果往往不够理想，缺少从分子水平快速准确鉴定种质资源方法的技术问题。本发明包括以下步骤：步骤1：利用农艺性状差异，筛选梯度分级标记；步骤2：利用筛选的梯度标记检测种质资源；步骤3：根据梯度标记对作物种质资源的检测结果，评价资源遗传亲缘关系远近。本发明具有弥补传统表型鉴定技术的不足，增加资源鉴定的准确性和可靠性等优点。