本发明提供了一种分离纯化两性霉素B的杂质A、杂质B的方法，该方法主要通过动态轴向压缩制备色谱，得到两性霉素B的杂质A和杂质B纯品。具体包括以下步骤：在不同条件下加速破坏得到两性霉素B的杂质A和B溶液，以0.02M柠檬酸水溶液/乙腈为流动相进行洗脱，收集目标杂质馏分，用分析型高效液相色谱测定其纯度，纯度可达90％以上。改变流动相以水/乙腈进行再洗脱除盐，收集目标馏分，减压浓缩后得到目标产物。两性霉素B的相关杂质存在样品不稳定，分离制备难度大等特点，本发明所述的两性霉素B的杂质A和杂质B的分离纯化方法，具有分离效率高、分离速度快、操作简便等优点。