本发明涉及用于胚胎植入前线粒体基因检测的试剂盒、建库方法和测序方法，试剂盒包括预扩增试剂和指数扩增试剂，预扩增试剂含有用于预扩增线粒体靶基因的第一特异性引物对，指数扩增试剂含有用于对线粒体靶基因的预扩增产物进行指数扩增的第二特异性引物对，第二特异性引物对连接有测序接头序列。本发明的试剂盒通过预扩增试剂对线粒体靶基因进行预扩增，而后通过指数扩增试剂中对预扩增的产物进行指数扩增，相比于原胚胎样本，放大了线粒体靶基因占全基因组DNA的比例，对于低频的线粒体基因变异也能准确检出，从而提高了胚胎植入前线粒体基因检测的灵敏度和准确度。