本发明公开一种ε‑己内酯高产菌株的高通量筛选方法，属于高通量筛选技术领域。本发明将ADH和CHMO双酶级联反应产物ε‑己内酯的浓度与中间产物环己酮的浓度进行相关性分析发现，具有不同催化性能的菌株在全细胞催化反应后，中间产物环己酮浓度与产物ε‑己内酯浓度呈负相关关系，因此以环己酮为筛选标记，通过高通量筛选具有低环己酮浓度的菌株得到高产ε‑己内酯的菌株。本发明利用RBS工程技术构建ε‑己内酯产生菌的突变文库，筛选得到的七株突变菌株并进行摇瓶实验验证，催化70mM环己醇的ε‑己内酯产量，与出发菌株RCL0相比均获得显著提高。该方法操作步骤简单，可大幅降低菌株筛选过程的实验成本并缩短筛选周期。