本发明公开了一种基于羟基自由基监测的汽化过氧化氢灭菌强化方法，该方法包括在隔离器内部布置生物指示剂，保持向隔离器内注入干燥压缩空气，向隔离器内注入汽化过氧化氢蒸汽，当隔离器中羟基自由基的浓度值达到C1以上时，减缓汽化过氧化氢蒸汽的注入速度，以维持羟基自由基浓度值在C1±5％C1，保持灭菌直至达到灭菌时间，停止注入汽化过氧化氢蒸汽，引入无菌新风置换过氧化氢，将菌片放入培养基培养，观察培养基的变色情况，若未变色则达到灭菌目的。本发明的方法能有效达到空间气体灭菌的指标，可缩短灭菌耗时，工艺步骤简单，操作简便。