本发明公开了一种分离纯化水牛原代成肌细胞的方法及其应用。本发明所述方法通过将水牛背最长肌肌肉组织块依次经过I型胶原酶和胰蛋白酶消化后过细胞筛得原代成肌细胞，并通过差速贴壁法进行水牛成肌细胞的纯化。相对现有通过分化获得牛成肌细胞的方法来说，本发明所述分离纯化水牛原代成肌细胞的方法的操作简单，耗费时间少。同时，利用本发明所述分离纯化方法获得的水牛原代成肌细胞不仅纯度高，其活性也高，细胞的分化融合效果好，可用于构建水牛肌肉发育研究模型，极具实用价值和推广意义。