本实用新型提供一种应用于水生动物病原检测的胶体金试纸划线笔，包括一笔头和一笔身，笔头螺接于笔身的底端；笔头包括一滚珠笔尖和一进液管，滚珠笔尖连接于笔头的底端，进液管固定于笔头内且一端接近滚珠笔尖另一端形成一第一进液针；笔身包括一笔身本体以及自下而上设置于笔身本体内的一隔离橡胶膜、一储液管、一单向阀组件和一连接口；第一进液针刺破隔离橡胶膜部分伸入储液管；连接口形成于笔身的顶端通过单向阀组件与储液管连通。本实用新型的一种应用于水生动物病原检测的胶体金试纸划线笔，成本低，笔头可更换，结实耐用，节约实验材料，可避免实验材料的污染并具有半定量效果。