本发明公开了一种用于连续检测铜离子和高半胱氨酸的荧光探针及其制备方法和应用。所述荧光探针PTNPy是由3‑(4‑甲基‑噻吩氧基)丙基三甲基溴化铵与[3‑(4‑甲基‑噻吩氧基)丙基]‑双吡啶‑2‑亚甲基胺经三氯化铁氧化聚合而成。PTNPy在水溶液中发射强烈的荧光，与铜离子结合后形成复合物，由于铜离子的顺磁性，PTNPy溶液的荧光被淬灭。当加入高半胱氨酸后，Hcy能与Cu²⁺生成更加稳定的络合物Hcy‑Cu²⁺，从而将PTNPy从PTNPy/Cu²⁺复合物中释放出来，其荧光恢复。该PTNPy荧光探针合成方法简单，水溶性好，响应速度快，选择性高，可用于水溶液中Cu²⁺和Hcy的连续定量检测，也可用于活细胞中Cu²⁺和Hcy的荧光成像及活细胞中Hcy含量波动监测。