本发明属于细胞生物学技术领域，提出了一种人神经祖细胞分化方法及其在毒性测试中的应用，包括如下步骤：S1:使用预冷枪头吸取Matrigel，加入至预冷的Advanced DMEM/F12培养基稀释，制成Matrigel包被液，并将Matrigel包被液预冷；S2:将预冷Matrigel包被液转移至培养皿中，并放置于培养箱中静置，得Matrigel包被培养皿；S3:将融合度达到70‑80％的hNPC细胞，使用PBS洗涤，Accutase消化酶进行消化；S4:将离心管中的细胞离心去上清，采用NPC维持培养基并加入ROCK inhibitor重悬细胞后，接种于Matrigel包被培养皿中进行培养；S5:第二天吸弃Matrigel包被培养皿中液体，换新鲜的神经元分化培养基进行培养。本发明将神经祖细胞分化为神经元的细胞模型，其神经元具有人源神经元的形态和特征，此后在该细胞的基础上建立神经发育毒性的体外测试方法。