本发明公开了一种常见病原菌及耐药基因组的焦磷酸检测试剂盒及其检测方法和应用，其中，所述试剂盒用于检测待测样本中12个耐药菌菌种及耐药基因，包括铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、嗜麦芽窄食单胞菌、大肠埃希氏菌、粪肠球菌、屎肠球菌、KPC基因、OXA‑23基因、SHV基因和MecA基因的基因型，所述试剂盒包括扩增引物组、测序引物组、扩增液、扩增酶和测序底物。本发明采用焦磷酸测序法可同时针对12种高致病性高检出率的病原菌及耐药基因进行检测，可随意组合待测病原菌及耐药基因，针对不同的环境进行不同频率和组合的检测，检测过程灵活简便，焦磷酸测序结果快速可读。