本发明公开了一种革兰氏阴性细菌耐药基因检测方法及其专用芯片与试剂盒。该试剂盒包括扩增待测革兰氏阴性细菌菌株的耐药基因的引物对，和检测所述革兰氏阴性菌菌株的耐药基因探针。利用该试剂盒进行耐药基因检测的方法，包括：1)利用试剂盒中的引物PCR扩增待测菌株的耐药基因；2)将扩增产物与所述检测革兰氏阴性菌耐药基因探针进行杂交，确定待测菌株所含耐药基因。本发明的试剂盒具有集成化程度高、灵敏度高，应用范围广，特异性高，检测结果稳定，可靠性高的特点。