本发明公开了一种能同时检测人体尿液中多种抗生素的分析方法，通过固相萃取的前处理方法结合液相色谱‑质谱联用仪的方法同时检测人体尿液中五大类共18种抗生素药物。首先将尿液样本先解冻后离心得上清液，取上清液并加入EDTA‑2Na缓冲液，β‑葡萄糖醛酸酶水溶液以及混合标准储备液，过夜水解；再使用固相萃取小柱净化、提取和富集尿液样品中的18种目标待测物质；然后利用高效液相色谱‑质谱联用仪为检测平台定性、定量检测尿液中目标物质。本发明步骤简单，操作方便，稳定性好，能够快速得出实验数据；样品预处理成本低。另外，此方法还可同时对18种抗生素类物质进行检测，检测速度快，自动化程度高，回收率能高，能提高产业化水平，适应于推广利用。